Глава 24. Коронавирус sars-cov-2 в 2006 году

Глава 24. Коронавирус SARS-CoV-2 в 2006 году.

Ричард Флеминг в своей работе впервые выяснил, что коронавирус под названием SARS-CoV-2 существовал уже в 2006 году. Правда неизвестно, тот ли это коронавирус, который вызвал пандемию COVID-19, или нет. Статья alexfisich от 6 ноября  2021 года на эту тему.

Не тот Федот? SARS- CoV2 в 2006 году

Приготовление химерной армированной РНК в качестве универсального калибратора для множественных тестов на вирусы

Цюин Хуан, Янцзян Чэн, Цивэй Го, Цингэ Ли

Клиническая химия, том 52, выпуск 7, 1 июля 2006 г., страницы 1446–1448, https://doi.org/10.1373/clinchem.2006.069971

Опубликовано:
01 июля 2006 г.

Как и все диагностические методы, молекулярное тестирование требует тщательного контроля качества (1) (2) (3). При обнаружении РНК-вирусов, которые часто присутствуют в низких концентрациях и склонны к деградации, необходим строгий мониторинг всех аспектов выполнения анализа, включая лизис вируса, выделение РНК, обратную транскрипцию, амплификацию и этапы обнаружения. Среди многих предлагаемых препаратов для контроля РНК (4) (5) бронированная РНК в настоящее время является наиболее подходящей для клинического применения, поскольку она несет интересующую вирусную РНК-мишень в форме, устойчивой к рибонуклеазам, неинфекционной и стабильной после длительной инкубации в клинических условиях. матриксы и препараты значительно дешевле в производстве, чем инфицированная вирусом плазма (6) (7) (8). Таким образом, бронированная РНК применялась в качестве положительного контроля для множества РНК-вирусов (9).

Поскольку большинство коммерческих препаратов бронированной РНК содержат экзогенные последовательности из <500 нуклеотидов (9), отдельные виды бронированной РНК часто готовят для калибровки каждой мишени в нескольких вирусных анализах. Чтобы снизить затраты и упростить обнаружение мультивирусов, мы стремимся создать один химерный бронированный вид РНК, который можно было бы использовать в качестве положительного контроля для множества вирусных мишеней. Мы считаем эту задачу выполнимой, потому что изобретатели бронированной РНК предсказали, что теоретически может быть инкапсулировано не менее 2 т.п.н. последовательности небактериофаговой РНК (8). В качестве доказательства этого принципа мы попытались напрямую упаковать последовательность чужеродной РНК длиной 1200 нуклеотидов, содержащую фрагменты генов вируса гепатита С (ВГС), ВИЧ-1, коронавируса 1 (SARS-CoV1) и SARS- CoV2 в исходный вектор продуцирования армированной РНК pAR-1 (8).

Мы сплайсировали 4 целевые последовательности кДНК, перекрывая удлинение (10). После клонирования химерной последовательности с 4 мишенями (см. Приложение к данным, прилагаемое к онлайн-версии этого письма по адресу http://www.clinchem.org/content/vol52/issue7/ для получения информации о последовательностях 4 фрагментов, а также праймеры и зонды) в pAR-1, мы использовали простую, но понятную процедуру для подтверждения продукции армированной РНК и ее очистки. Вкратце, после индукции продукции армированной РНК мы обрабатывали супернатант лизата клеток Escherichia coli РНКазой А и ДНКазой I. При тестировании с помощью электрофореза в агарозном геле, если была произведена армированная РНК, могла быть видна одна полоса ДНК размером ~ 1,5 т.п.н. Затем мы вырезали полоску из геля и помещали в диализный мешок для электроэлюции. Используя этот метод, мы успешно экспрессировали и очистили химерную бронированную РНК. Мы использовали чистый фрагмент транскрипта РНК SARS-CoV2 (BNI) для калибровки химерной армированной РНК, а затем использовали химерную армированную РНК для приготовления калибраторов 4-х анализов с обратной транскрипцией в реальном времени (RT-PCR) (рис. 11). ; также см. рис. 1 в онлайн-дополнении к данным) на основе смещающих зондов (11). Линейный диапазон для каждого анализа не изменился, когда калибраторы хранились при 37 ° C в течение 2 недель, при 4 ° C в течение 6 месяцев или при -20 ° C в течение 1 года.

Наша работа показывает, что несколько целевых последовательностей могут быть инкапсулированы в один бронированный вид РНК, чтобы служить общим калибратором для обнаружения различных РНК-вирусов. Химерная армированная РНК даже большего размера может быть получена аналогичным образом, на что указывает наш вывод о том, что путем удаления некоторых одноразовых последовательностей между сайтом множественного клонирования и терминатором транскрипции мы смогли увеличить упаковочную способность вектора pAR-1, не влияя на эффективность упаковки. (данные не показаны). Таким образом, химерный, многоцелевой подход к получению бронированной РНК является практичным и может снизить трудозатраты и затраты на контроль качества анализов мультиплексных РНК-вирусов.

Рисунок 1.
Калибровка анализа RT-PCR в реальном времени на HCV, HIV-1, SARS-CoV1 и SARS-CoV2.
Открыть в новой вкладке Скачать слайд

Калибровка анализа RT-PCR в реальном времени на HCV, HIV-1, SARS-CoV1 и SARS-CoV2.

Мы разбавили очищенную и откалиброванную армированную РНК объединенной нормальной человеческой плазмой с добавлением 1 г / л азида натрия и приготовили аликвоты по 200 мкл путем 10-кратного серийного разведения для получения образцов, содержащих от 1010 до 101 копий. Из этих материалов мы выделили матричную РНК в диапазоне от 1010 до 101 копий (слева направо) для анализов ОТ-ПЦР. Воду использовали в качестве отрицательного контроля. Все шаблоны РНК были проанализированы за один проход с использованием набора диагностических реагентов (Intec) для каждого отдельного вируса. ОТ-ПЦР в реальном времени проводили на термоциклере iCycler iQ (Bio-Rad).

Мы благодарим Xilin Zhao и Karl Drlica за критические комментарии к рукописи. Эта работа была частично поддержана Фондом естественных наук правительства Фуцзянь (2003–2004 гг.), Ключевой программой муниципальной комиссии по науке и технологиям Сямыня и проектом действий Университета Сямэня.
1

Hoorfar J, Malorny B, Abdulmawjood A, Cook N, Wagner M, Fach P. Практические соображения при разработке внутренних контролей амплификации для диагностических ПЦР-анализов. J Clin Microbiol
2004 г.
; 42
: 1863
-1868.

2

Nolte FS. Новый внутренний контроль для ПЦР в реальном времени. Clin Chem
2004 г.
; 50
: 801
-802.

3

Walkerpeach CR, Pasloske BL. ДНК-бактериофаг в качестве контроля для клинических испытаний на вирусы. Clin Chem
2004 г.
; 50
: 1970
-1971.

4

Burggraf S, Olgemoller B. Простая процедура внутреннего контроля анализов амплификации обратной транскрипции в реальном времени. Clin Chem
2005 г.
; 51
: 1508
-1510.

5

Дингл К.Э., Крук Д., Джеффри К. Внутренний контроль стабильной и неконкурентной РНК для рутинной клинической диагностической ПЦР с обратной транскрипцией. J Clin Microbiol
2004 г.
; 42
: 1003
-1011.

6

Pasloske BL, Walkerpeach CR, Obermoeller RD, Winkler M, Dubois DB. Технология бронированной РНК для производства устойчивых к рибонуклеазам вирусных РНК контролей и стандартов. J Clin Microbiol
1998 г.
; 36
: 3590
-3594.

7

WalkerPeach CR, Winkler M, DuBois DB, Pasloske BL. Контроли РНК, устойчивые к рибонуклеазам (бронированная РНК) для ПЦР с обратной транскрипцией, разветвленной ДНК и генотипирования вируса гепатита С. Clin Chem
1999 г.
; 45
: 2079
-2085.

8

Паслоске Б.Л., Дюбуа Д.Б., Браун Д.М., Винклер М.М., изобретатели. Методы количественной оценки вирусной нагрузки у животных с препаратом РНК, устойчивой к рибонуклеазе. Патент США № 6,399,307, выданный 4 июня 2002 г.
9

Диагностика AsuraGen. Армированные РНК-продукты. http://www.asuragendx.com/products/armored_rna_other.html (по состоянию на март 2006 г.).
10

Хортон Р. М., Хант HD, Хо С. Н., Пуллен Дж. К., Пиз Л. Р.. Разработка гибридных генов без использования рестрикционных ферментов: сплайсинг генов путем перекрывающегося удлинения. Ген
1989 г.
; 77
: 61
-68.

11

Li Q, Luan G, Guo Q, Liang J. Новый класс гомогенных зондов нуклеиновых кислот, основанный на специфической гибридизации смещения. Нуклеиновые кислоты Res
2002 г.
; 30
: e5
.

© 2006 Американская ассоциация клинической химии
Эта статья публикуется и распространяется в соответствии с условиями модели публикации стандартных журналов Oxford University Press Дополнительные данные
Clinchem.2006.069971-1 - файл doc



Первое упоминание вируса SARS-CoV-2 можно найти в статье, опубликованной 1 июля 2006 года в томе 52 журнала Clinical Chemistry на страницах 1446-1448. Авторами статьи являются сотрудники Сямыньского университета в провинции Фуцзян. Название статьи: Preparation of a Chimeric Armored RNA as a Versatile Calibrator for Multiple Virus Assays.

Не станем утверждать, что ученые в Фуцзяне работали с тем же вирусом, который вызвал пандемию COVID-19, хотя и исключать этого нельзя. Отметим лишь, что в научной среде не принято давать название, которое уже задействовано для объекта А, совсем другому объекту Б, если тот, кто дает название объекту Б, знает про объект А.

Если эксперты ВОЗ дали такое же название другому вирусу, хотя название уже было занято в статье 2006 года, то эти эксперты не знали об этой статье. Тогда возникает вопрос, что же они за эксперты. А если они компетентны, то это тот же вирус.

ИА Красная Весна