Глава 15. Версия Сегрето-Дейгина

Глава 15. Версия Сегрето-Дейгина.

Как мы помним, большинство учёных, которые подписали "Письмо 27-и" в феврале 2020 года, осознавали, что участок расщепления фурина, скорее всего, был результатом лабораторных манипуляций. Однако Фаучи сотоварищи заткнул им рот, заставив следовать утверждённому высокими медицинскими чиновниками нарративу: коронавирус SARS-CoV-2 имеет естественное происхождение.Тем не менее с течением времени другие, не связанные с Фаучи, учёные также должны были обратить внимание на участок ращепления фурина как на результат лабораторных манипуляций.Первыми это сделали Далглиш-Соренсен в своей статье, но она долгое время тормозилась редакциями научных журналов. Наконец, это произошло спустя 9 месяцев в работе австрийской исследовательницы из Университета Инсбрука Россаны Сегрето(фото вверху) и канадского биохимика русского происхождения Юрия Дейгина. Эта статья  в журнале BioEssays от 17 ноября 2020 года заложила основы дальнейшего исследования проблемы лабораторного происхождения коронавируса. 29 января 2021 года Карл Куэй, используя байесовский анализ участка расщепления фурина, доказал, что вероятность /искусственого/естественного происхождения коронавируса составляет 99,5%/0,5%.

 Вот эта статья.

Генетическая структура SARS-CoV-2 не исключает лабораторного происхождения.
Химерная структура SARS-COV-2 и сайт расщепления фурина могут быть результатом генетических манипуляций.

Rossana Segreto, Юрий Дейгин
Впервые опубликовано:17 ноября 2020 https://doi.org/10.1002/bies.202000240Цитат: 54

Для этой работы не было получено внешнего финансирования.

Россана Сегрето и Юрий Дейгин внесли равный вклад в это исследование.

Аннотация

Происхождение тяжелого острого респираторного синдрома-коронавируса (SARS-CoV)-2 по-прежнему остается спорным. Геномный анализ показывает, что SARS-CoV-2, вероятно, является химерным, большая часть его последовательности наиболее близка к bat CoV RaTG13, тогда как его рецепторсвязывающий домен (RBD) почти идентичен домену панголина CoV. Химерные вирусы могут возникать в результате естественной рекомбинации или вмешательства человека. Сайт расщепления фурина в спайковом белке SARS-CoV-2 придает вирусу способность преодолевать видовые и тканевые барьеры, но ранее не наблюдался у других SARS-подобных CoV. Могли ли быть выполнены генетические манипуляции для оценки панголинов в качестве возможных промежуточных хозяев для КОВОВ, полученных от летучих мышей, которые изначально не могли связываться с рецепторами человека? Как сайт расщепления, так и специфический RBD могут быть результатом сайт-направленного мутагенеза, процедуры, которая не оставляет следов. Учитывая разрушительное воздействие SARS-CoV-2 и важность предотвращения будущих пандемий, исследователи обязаны провести тщательный анализ всех возможных источников SARS-CoV-2.

Введение

Прошел почти год с момента вспышки тяжелого острого респираторного синдрома-коронавируса 2 (SARS-CoV-2) в Ухане, Китай, и его происхождение до сих пор остается спорным. Несмотря на проведенные международные исследования, естественный хозяин, прямой или промежуточный, до сих пор не идентифицирован. Гипотеза о том, что оптовый рынок морепродуктов в Ухане Хуанань был первым источником передачи вируса от животного к человеку, в настоящее время окончательно опровергнута , и в нескольких взятых на рынке образцах был обнаружен только адаптированный к человеку SARS–CoV-2, без следов зоонозных штаммов-предшественников . Почти во всех научных статьях, опубликованных на сегодняшний день, утверждается, что SARS-CoV-2 имеет естественное происхождение, и единственная опубликованная статья, рассматривающая возможное лабораторное происхождение [1], фокусируется на серийном прохождении как методе, который может оправдать особую адаптацию SARS-CoV-2 к клеткам человека. Здесь мы описываем, как две основные особенности SARS-CoV-2: (1) наличие сайта расщепления фурина, отсутствующего у других COV той же группы, и (2) домен, связывающий рецептор (RBD), оптимизированный для связывания с клетками человека [2], могут быть результатом методов лабораторных манипуляций, например, сайт-направленный мутагенез. Менее вероятно, что приобретение обоих уникальных признаков SARS-CoV-2 более или менее одновременно является естественным или вызвано только последовательным прохождением клеток / животных.

БЛИЖАЙШИМИ РОДСТВЕННИКАМИ SARS-COV-2 ЯВЛЯЮТСЯ КОРОНАВИРУСЫ ЛЕТУЧИХ МЫШЕЙ И ЯЩЕРОВ

Чжоу и др.[3] из Уханьского института вирусологии (WIV) первыми идентифицировали и охарактеризовали новый коронавирус (CoV), SARS-CoV-2. Геномные последовательности, полученные из ранних случаев, на 79% совпадали с CoV, которые вызвали тяжелый острый респираторный синдром (SARS-CoV) в 2002-2003 годах, и на 96,2% совпадали с RaTG13 (MN996532), последовательностью CoV, обнаруженной у летучей мыши Rhinolophus affinis. RaTG13 в настоящее время является ближайшим филогенетическим родственником SARS-CoV-2, [4] но его полная геномная последовательность не была опубликована до вспышки SARS-CoV-2, а исходный образец был собран в провинции Юньнань (Китай) той же группой исследователей из женщин в 2013 году. Чжоу и др.[3] заявили, что нашли совпадение между SARS-CoV-2 и короткой областью РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) CoV в своей базе данных, а затем полностью секвенировали исходный образец, собранный в 2013 году, который они назвали RaTG13.

Мы обнаружили, что RdRp RaTG13 имеет 100% нуклеотидную идентичность с последовательностью BtCoV / 4991 (KP876546), которая была идентифицирована Ge et al.[5] у летучей мыши Rhinolophus affinis в провинции Юньнань в 2013 году, в том же месте и в том же году, что и RaTG13. BtCoV / 4991 был собран в шахте, колонизированной летучими мышами, недалеко от Тунг-Гуаньчжэнь, Моцзян, Юньнань. Исследователи WIV были приглашены для исследования шахты после того, как шесть шахтеров заболели тяжелой пневмонией в  2012 году, и трое шахтеров умерли.[6] Шахтерам было поручено очистить шахту от помета летучих мышей, и тяжесть их пневмонии коррелировала с продолжительностью пребывания в шахте.[7] Образцы четырех шахтеров впоследствии прошли тестирование в WIV, где во всех образцах были обнаружены антитела к иммуноглобулину G (IgG) против SARS.[8] Учитывая, что только около 5300 человек были инфицированы в материковом Китае во время вспышки атипичной пневмонии в 2002-2004 годах, большинство из которых проживали в Гуандуне, вероятность того, что у четырех шахтеров в Юньнани сохранились антитела от вспышки атипичной пневмонии в 2002-2004 годах, ничтожно мала. С другой стороны, возможно, что тест на антитела к SARS, проведенный шахтерам, дал перекрестную реакцию с новым вирусом летучих мышей, подобным SARS, который шахтеры приобрели на шахте. Ge и соавт.[5] идентифицировали ряд CoV в шахте, но, основываясь на филогенетическом анализе, BtCoV / 4991 был единственным штаммом, связанным с SARS, четко отделенным от всех известных на тот момент альфа- и бета-CoV.BtCoV /4991 также отличался от других видов летучих мышей в филогенетическом анализе, проведенном Wang et al. в 2019 году.[9] Чен и др.[10]  идентифицировали BtCoV / 4991 как наиболее близкую последовательность к SARS-CoV-2, поскольку RaTG13 на тот момент еще не был опубликован.Позже было заявлено, что BtCoV / 4991 и RaTG13 являются двумя разными кодирующими названиями одного и того же штамма, поскольку их первоначальные авторы в WIV зарегистрировали два штамма как одну запись в базе данных вирусов, ассоциированных с летучими мышами (DBatVir).iv

В конце июля 2020 года Чжэнли Ши, ведущий исследователь CoV из WIV, в интервью по электронной почте [11] заявил о переименовании образца RaTG13 и неожиданно заявил, что полное секвенирование RaTG13 было проведено еще в 2018 году, а не после вспышки SARS-CoV-2, поскольку указано в Zhou et al.[3] Изменение позиции WIV в отношении того, когда именно RaTG13 был полностью секвенирован, могло быть связано с открытием независимыми исследователями происхождения SARS-CoV-2, что имена файлов необработанного секвенирования были переданы WIV 19 мая 2020 годаv, по-видимому, указывает на то, что секвенирование RaTG13 было проведено в 2017 году и 2018. Тем не менее, никаких объявлений официальных ошибок о годе секвенирования и переименовании образца от авторов Zhou et al. [3] еще не появилось или, насколько известно в настоящее время, не было представлено.

Второй нечеловеческой последовательностью RdRp, наиболее близкой к BtCoV / 4991 (91,89% идентичности нуклеотидов), является последовательность CoV MP789 (MT084071), выделенная в 2019 году у малайзийского панголина (Manis javanica) из провинции Гуандун (GD), Китай.[12]Белок оболочки MP789 неожиданно демонстрирует 100% аминокислотную идентичность с соответствующим белком в RaTG13, в bat-SL-CoVZXC21 (MG772934.1), в bat-SL-CoVZC45 (MG772933.1) и в некоторых ранних изолятах SARS-CoV-2 (например, YP_009724392).[13] Белок оболочки COV участвует в критических аспектах жизненного цикла вируса, таких как проникновение вируса, репликация и патогенез.[14]

КОВЫ ЛЕТУЧИХ МЫШЕЙ БЫЛИ ТЩАТЕЛЬНО ИЗУЧЕНЫ И ПОДВЕРГНУТЫ ГЕНЕТИЧЕСКИМ МАНИПУЛЯЦИЯМ

Во многих исследованиях сообщалось, что летучие мыши являются естественными резервуарами для широкого спектра потенциально патогенных SARS-подобных CoV.[15, 16] Некоторые из этих вирусов потенциально могут напрямую заражать людей[17], в то время как другим необходимо мутировать их спайковый белок, чтобы эффективно связываться с человеческим ангиотензин-1-превращающим ферментом рецептор 2 (hACE2) и опосредует проникновение вируса.[18] Чтобы оценить потенциал появления новых CoV, исследователи создали ряд химерных CoV, состоящих из костных клеток bat CoV, обычно неспособных инфицировать клетки человека, чьи спайковые белки были заменены белками CoV, совместимыми с ACE2 человека. Эти химеры предназначались для имитации событий рекомбинации, которые могут происходить в природе.[19, 20] Такие эксперименты по усилению функции вызвали ряд проблем биобезопасности и вызвали споры среди исследователей и широкой общественности. Одним из главных аргументов в пользу исследований усиления функции является необходимость подготовки арсенала лекарств и вакцин для следующей пандемии.[21] Напротив, одним из основных аргументов против них является то, что сама следующая пандемия может быть вызвана этими экспериментами из-за риска побега из лаборатории.[22, 23]

В последние годы область коронавирусологии была сосредоточена на пан-КоВ терапии и вакцинах, о чем свидетельствуют исследования, проведенные за последние 5 лет [24-27], а также сообщения в средствах массовой информации.  Целью активных грантов было объявлено синтетическое создание разнообразных панелей потенциальных предэмерджентных КОВ для Альянса экологического здравоохранения, который финансировал некоторые из таких исследований в WIV в сотрудничестве с лабораториями в США и другими международными партнерами.

СОЗДАНИЕ ХИМЕРНЫХ COV С НОВЫМИ RBD ПРОДОЛЖАЕТСЯ ДЕСЯТИЛЕТИЯМИ

Исследователи создавали химерные CoV более двух десятилетий, задолго до появления современных методов секвенирования или генной инженерии. Например, в 1999 году группа из Утрехтского университета использовала целенаправленную рекомбинацию РНК для создания CoV-химеры “кошки-мышки”: RBD кошачьего и мышиного CoV были заменены, демонстрируя, что этот обмен также менял тропизм видов во время экспериментов in vitro.[28]

В 2007 году группа Shi в WIV создала серию химерных шиповых белков CoV “человек-летучая мышь”, пытаясь определить, что именно придает CoV способность переходить от одного вида к другому. Исследователи использовали различные сегменты спайкового белка вируса SARS человека для замены соответствующих сегментов в спайковом белке вирусной основы летучей мыши. Был сделан вывод, что относительно короткая область (от 310 до 518 аа) белка spike “была необходимой и достаточной для превращения Rp3-S в молекулу, связывающую huACE2”,29 это должно обеспечить белку-шипу bat CoV новую способность связываться с рецептором ACE2 человека.

В 2008 году группа Baric из Университета Северной Каролины (UNC) продвинула исследование WIV на один шаг дальше: вместо использования псевдовирусов вирусов иммунодефицита человека (ВИЧ) с белками-шипами bat CoV был создан живой химерный CoV. После экспериментов своих коллег из WIV 2007 года группа Baric использовала в качестве основы SARS-подобный CoV летучей мыши и заменила его RBD на RBD от SARS человека.[30]

В 2015 году группы Shi и Baric объединили усилия и опубликовали, вероятно, самую известную работу по вирусологии, в которой описывалось создание другого синтетического химерного вируса.[19] На этот раз RBD адаптированного к мышам костяка SARS (SARS-MA15) был заменен RBD RsSHC014, штамма летучих мышей, ранее выделенного из юньнаньских летучих мышей в 2011 году группой Shi. В 2016 году группа Baric повторила свой эксперимент 2015 года, используя ту же магистраль SARS-MA15 и RBD из Rs3367,[31] близкого родственника RsSHC014, также ранее обнаруженного в Юньнани WIV и переименованного в “WIV1” после культивирования вживую.[17]

Вероятно, наибольшее количество новых созданных химерных вирусов, о которых сообщалось, было описано в статье 2017 года группы Shi в WIV[15], в которой авторы сообщили о создании восьми химерных вирусов с использованием WIV1 в качестве основы и пересадке в него различных RBD от SARS-подобных вирусов летучих мышей. Эти вирусы были собраны в течение 5 лет из той же пещеры близ Куньмина, провинция Юньнань, где группа Shi первоначально обнаружила Rs3367 и RsSHC014. Только два из восьми живых химерных вирусов были успешно спасены, и было обнаружено, что эти два штамма обладают способностью связываться с рецептором ACE2 человека, что подтверждено экспериментами на hACE2-экспрессирующих клетках HeLa и количественным определением вирусной РНК методом ОТ-ПЦР.

SARS-COV-2 РАЗДЕЛЯЕТ СВОЙ RBD С ПАНГОЛИНОМ COV

Возможность того, что ящеры могут быть промежуточными хозяевами для SARS-CoV-2, уже давно обсуждается. [32-34] Наибольшее расхождение между SARS-CoV-2 и RaTG13 наблюдается в RBD их спайковых белков.[4] Хотя его общее сходство с геномом SARS-CoV-2 ниже, чем у RaTG13, штамм панголинов MP789, выделенный из панголинов GD, имеет почти идентичный RBD у SARS-CoV-2. Действительно, pangolin CoV и SARS-CoV-2 содержат идентичные аминокислоты в пяти критических остатках RBD, тогда как RaTG13 разделяет только одну аминокислоту с SARS-CoV-2.[35] Сходство последовательностей ACE2 выше между людьми и ящерами, чем между людьми и летучими мышами. Интересно, что спайковый белок SARS-CoV-2 обладает более высокой предсказанной аффинностью связывания с человеческим рецептором ACE2, чем у панголинов и летучих мышей. До вспышки SARS-CoV-2 панголины были единственными млекопитающими, кроме летучих мышей, у которых были зарегистрированы переносчики и заражение SARS-CoV-2, связанными с CoV.[12] События рекомбинации между RBD CoV от панголинов и RaTG13-подобным позвоночником могли привести к образованию SARS-CoV-2 как химерного штамма. Чтобы такая рекомбинация произошла естественным образом, два вируса должны были одновременно заразить одну и ту же клетку в одном и том же организме, что довольно маловероятно, учитывая низкую плотность популяции панголинов и редкое присутствие COV в их естественных популяциях.  Более того, исследования связывания с рецепторами восстановленного RaTG13 показали, что он не связывается с панголин ACE2.

МЕСТО РАСЩЕПЛЕНИЯ ФУРИНА: КЛЮЧЕВОЕ РАЗЛИЧИЕ МЕЖДУ SARS-COV-2 И ЕГО БЛИЖАЙШИМ РОДСТВЕННИКОМ RATG13

SARS-CoV-2 отличается от своего ближайшего родственника RaTG13 несколькими ключевыми характеристиками. Наиболее поразительным отличием является приобретение в спайковом белке SARS-CoV-2 сайта расщепления, активируемого ферментом клетки-хозяина фурином, ранее не идентифицированным у других бета-COV линии b [36] и сходным с коронавирусом ближневосточного респираторного синдрома (MERS).[35] Обработка протеазой хозяина играет ключевую роль в качестве видового и тканевого барьера, а разработка мест расщепления белков-шипов CoV изменяет тропизм и вирулентность вируса.[37] Повсеместная экспрессия фурина в различных органах и тканях придала SARS-CoV-2 способность поражать органы, обычно неуязвимые для других коронавирусов, что приводит к системной инфекции в организме.[38] Культивированный SARS-CoV-2, у которого отсутствовал вышеупомянутый сайт расщепления, вызывал ослабленные симптомы у инфицированных хомяков, [39] и исследования мутагенеза подтвердили, что многоосновный сайт фурина необходим для способности SARS-CoV-2 заражать клетки легких человека.[40]

Многоосновный сайт фурина в SARS-CoV-2 был создан 12-нуклеотидной вставкой TCCTCGGCGGGC, кодирующей аминокислотную последовательность PRRA на соединении S1 / S2 (рисунок 1). Интересно, что два совместных аргинина кодируются двумя кодонами CGGCGG, которые редки для этих вирусов: только 5% аргининов кодируются CGG в SARS-CoV-2 или RaTG13, а CGGCGG в новой вставке является единственным удвоенным экземпляром этого кодона в SARS-CoV-2. Вставка CGGCGG
включает сайт рестрикции Fau I, из которых шесть экземпляров в SARS-CoV-2 и четыре экземпляра в RaTG13 (и два в MP789). Удачное расположение сайта Fau I может позволить использовать методы полиморфизма длины рестрикционного фрагмента (RFLP) [41] для клонирования [42] или скрининга на мутации [43], поскольку новый сайт furin подвержен делециям in vitro.[39, 44]

В исследовании Zhou et al.[45] сообщалось об открытии нового штамма CoV RmYN02, который, по утверждению авторов, демонстрирует естественные вставки аминокислот PAA в месте расщепления S1 / S2, где SARS-CoV-2 имеет вставку PRRA. Однако при тщательном изучении основной нуклеотидной последовательности RmYN02 по сравнению с его ближайшими предками bat-SL-CoVZC45 и bat-SL-CoVZXC21, никаких вставок не обнаружено, только нуклеотидные мутации (рисунок 2).

Таким образом, SARS-CoV-2 остается уникальным среди своих родственников бета-CoV не только из-за многоосновного сайта фурина на стыке S1 / S2, но и из-за четырех аминокислотных вставок PRRA, которые его создали. Вставка вызывает расщепление исходного кодона для серина (TCA) в MP789 или RaTG13 с образованием части нового кодона для серина (TCT) и части аминокислоты аланина (GCA) в SARS-CoV-2 (рисунок 3).

Вставка сайта расщепления фурина в SARS-CoV-2 не согласуется с остальной последовательностью по сравнению с последовательностями MP789 и RaTG13 (рисунок 3).

Следовательно, можно исключить, что такая вставка могла возникнуть в результате проскальзывания полимеразы или высвобождения и повторной инициализации, поскольку предполагалось, что мутации вставки, генерируемые этими механизмами, поддерживают рамку считывания вирусной последовательности.[46]Возможность того, что сайт расщепления фурина мог быть приобретен путем рекомбинации, недавно была поставлена под сомнение Сейраном и др.,[47] потому что белок-спайк SARS-CoV-2, по-видимому, не имеет каких-либо дальнейших событий рекомбинации в отличие от модели рекомбинации других CoV.

КРИТИКА "БЛИЖАЙШЕГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ SARS-COV-2"

Из-за широкого спектра исследований, проведенных в течение почти 20 лет в отношении SARS-CoV летучих мышей, оправданных их способностью передаваться от животного к человеку, [48] нельзя исключать возможное синтетическое происхождение SARS-CoV-2 путем лабораторной инженерии. В широко цитируемой статье Андерсена и др.[2] говорится, что SARS-CoV-2, скорее всего, имеет естественное происхождение. Основной аргумент, приведенный авторами, заключается в том, что высокоаффинное связывание белка-шипа SARS-CoV-2 с hACE2 не могло быть предсказано моделями, основанными на RBD SARS-CoV. На основе структурного анализа, проведенного Wan et al.,[49] SARS-CoV-2 обладает потенциалом для распознавания hACE2 более эффективно, чем SARS-CoV, который появился в 2002 году. Более того, генерация химерных штаммов CoV недавно продемонстрировала, что спайки bat CoV могут связываться с рецептором hACE2 с большей пластичностью, чем предполагалось ранее.[15]Все аминокислоты в RBD были тщательно проанализированы, и доступны новые модели для прогнозирования сродства к ACE2.[50] В связи с этим BatCoV Rs3367 (99.Было показано, что 9% идентичности с WIV1) разделяют с SARS-CoV-2 четыре из шести критических остатков в RBD. Учитывая, что было показано, что WIV1 напрямую связывается с hACE2, такое же предположение можно было бы легко сделать в отношении SARS-CoV-2 RBD.[51]

Как описано выше, создание химерных вирусов проводилось на протяжении многих лет с целью изучения потенциальной патогенности летучих мышей для людей. В этом контексте SARS-CoV-2 мог быть синтезирован путем объединения остова, подобного RaTG13, с RBD CoV, подобным тому, который недавно выделен у панголинов [12], поскольку последний характеризуется более высоким сродством с рецептором hACE2. Такие исследования могли быть направлены на выявление ящеров в качестве возможных промежуточных хозяев для bat-CoV, потенциально патогенных для людей. Последующий серийный пассаж клеток или животных, как описано Sirotkin & Sirotkin [1], мог бы обеспечить идеальную адаптацию RBD к hACE2.

Что касается сайта расщепления фурина, Андерсен и др.[2] заявляют, что “функциональные последствия многоосновного сайта расщепления при SARS-CoV-2 неизвестны”. Новые исследования нескольких групп в последнее время идентифицировали этот сайт активации как, возможно, позволяющий вирусу эффективно распространяться между людьми и поражать несколько органов.[52] Недавно были предложены эксперименты по протеолитическому расщеплению спайковых белков CoV в качестве будущих ключевых исследований для понимания возможности передачи вируса у разных хозяев.[50]

Andersen и др.[2] также утверждают, основываясь на работе Almazan и др.[53], что “генетические данные неопровержимо показывают, что SARS-CoV-2 не происходит от какой-либо ранее использовавшейся вирусной основы”. За последние 6 лет до вспышки SARS-CoV-2 количество потенциальных костяков летучих мышей, несомненно, увеличилось благодаря нескольким скринингам bat CoV, и последнее, но не менее важное, привлекло внимание ученых к RaTG13 в январе 2020 года. Другие возможные основные факторы также могут подождать публикации.

Андерсен и др.[2] утверждают, что “приобретение как сайта многоосновного расщепления, так и прогнозируемых О-связанных гликанов также противоречит сценариям, основанным на культуре”. Методы введения сайта многоосновного расщепления при инфекционном бронхите CoV приведены в Cheng et al.[54] и привели к повышенной патогенности. Что касается предсказанных О-связанных гликанов вокруг недавно вставленного многоосновного сайта, следует отметить, что это предсказание не было подтверждено Крио-ЭМ-исследованием гликопротеина SARS-CoV-2 spike.[55] Тем не менее, хотя верно, что О-связанные гликаны с гораздо большей вероятностью возникают при иммунном отборе, они могут быть добавлены в лаборатории с помощью сайт-направленного мутагенеза [56] или возникают в ходе экспериментов in vivo, например, у мышей BLT-L с имплантатами легких человека и аутологичная иммунная система человека[57] или у мышей, экспрессирующих рецептор hACE2.[31] Для преодоления проблем изоляции bat CoV были проведены эксперименты, основанные на прямой инокуляции bat CoV у крыс-сосунков.[58] Гуманизированные мыши, хорьки, приматы и / или другие животные с аналогичной конформацией ACE2 могли быть использованы для экспериментов по серийному прохождению, как подробно описано Сироткиным и Сироткиным.[1]

Андерсен и др.[2] также утверждают, что “последующее создание сайта многоосновного расщепления потребовало бы повторного прохождения в культуре клеток или животных с рецепторами ACE2, подобными человеческим, но такая работа также ранее не была описана”. Не следует исключать, что такие эксперименты могли быть прерваны из-за вспышки SARS-CoV-2 до возможной публикации результатов или что результаты никогда не предназначались для публикации.

Важно отметить, что последовательности RaTG13 и pangolin CoV от контрабандных панголинов, конфискованных в провинции Гуандун в марте 2019 года, и на которые ссылается большинство опубликованных работ, подтверждающих естественное происхождение SARS-CoV-2[2], недавно были поставлены под сомнение относительно точности их данных о сборе xii и требуются дальнейшие анализы, чтобы доказать их правильность.[xiii,xiv] Следует также отметить, что исследования связывания восстановленного RaTG13 с рецепторами in vitro дали некоторые своеобразные результаты.[xi] Самым удивительным наблюдением было то, что RaTG13, в отличие от SARS-CoV-2, не способен связывать ACE2 в R.летучие мыши macrotis, близкий родственник предполагаемого хозяина RaTG13, R. affinis[59] (чей рецептор ACE2 еще не был протестирован). В то же время наблюдалось, что RaTG13 связывает hACE2[60], но не так хорошо, как ACE2 крыс и мышей, с которыми SARS-CoV-2 вообще не связывался. Возможно ли, что так же, как SARS-MA15 был адаптированным к мышам штаммом SARS, RaTG13 на самом деле является адаптированной к мыши версией CoV, извлеченной из пещеры Модзян, а не штаммом, полученным из мазка фекалий летучей мыши? К сожалению, образец RaTG13 исчерпан, и он больше не доступен для внешнего обследования,[11], что вызывает сожаление, учитывая ряд несоответствий в исходных данных его секвенирования. Кроме того, статус и доступность образцов шахтеров Моцзяна также остаются открытым и весьма актуальным вопросом. Было собрано несколько образцов от шахтеров [7, 8] и, вероятно, сохранено, и было бы очень полезно проверить их на наличие SARS-CoV-2-подобных CoV.

Другим открытым вопросом является причина модификации и последующего удаления собственной вирусной базы данных WIV. В мае 2020 года несколько средств массовой информации сообщили, что система отслеживания изменений внутренней базы данных WIV показала, что база данных была переименована из “Базы данных вирусных патогенов, передаваемых дикой природой” в “Базу данных вирусных патогенов, передаваемых летучими мышами и грызунами”, а ее описание было отредактировано, чтобы заменить экземпляры “дикое животное” на“летучая мышь и грызун”; кроме того, было удалено упоминание о “переносчиках членистоногих”.xv В описании базы данных сообщалось, что она содержит более 60 Мб данных в формате structured query language (SQL), но по состоянию на начало мая 2020 года ссылка для скачивания больше не работала.xvi Впоследствии страница базы данных была удалена полностью, но ее снимок по-прежнему доступен в веб-архиве.xvii Это возможно, что другие международные лаборатории CoV могли загрузить архив SQL базы данных WIV до того, как он был удален, и в этом случае такие группы должны сделать эти данные общедоступными.

КАК ВИРУС МОГ ВЫРВАТЬСЯ ИЗ ЛАБОРАТОРИИ?

Утечка особо опасных патогенов из лабораторий не является редким событием, и случаи были задокументированы в нескольких странах. Наиболее заметной известной утечкой в лаборатории является побег вируса H1N1 1977 года из Китая, который вызвал всемирную пандемию.[61] Самой последней вспышкой бруцеллеза, произошедшей в ноябре 2019 года в двух исследовательских центрах в Ланьчжоу, Китай, в результате которой заразились более 100 студентов и сотрудников.[62] Также сообщалось о нескольких лабораторных побегах первого вируса SARS: летом 2003 года в Сингапуре,[63] затем в декабре 2003 года на Тайване,xviii и весной 2004 года дважды в Китае.xix

В 2018 году сотрудники посольства США после посещения института и интервью с Чжэнли Ши выразили обеспокоенность по поводу безопасности лаборатории WIV. Аудиторы лаборатории изложили свои опасения в последующих дипломатических телеграммах в Вашингтон. xx Китайские эксперты также выразили обеспокоенность по поводу безопасности лабораторий в своей стране, посетовав, что “лабораторный мусор может содержать искусственные вирусы, бактерии или микробы” и что “некоторые исследователи сбрасывают лабораторные материалы в канализацию после экспериментов без определенного механизма биологического удаления”.xxi

Американские лаборатории также столкнулись с проблемами безопасности. Недавно исследовательские работы на объекте Медицинского исследовательского института инфекционных заболеваний армии США (BSL)-4 уровня биобезопасности (USAMRIID) в Форт-Детрике были прерваны в августе 2019 года из-за нарушений техники безопасности, в частности, связанных с утилизацией инфекционных материалов.xxii Другие лаборатории США также упоминались по вопросам безопасности.22]

Можно выдвинуть гипотезу о ряде сценариев, вызывающих утечку SARS-CoV-2 из лаборатории. Например, зараженное животное могло сбежать из лаборатории, или оно могло поцарапать или укусить работника (в 2017 году была высказана обеспокоенность по поводу создания центра тестирования вакцины против приматов BSL-4 в Куньмине, Юньнань [64]), или исследователь мог случайно ввести себе прививку (как произошло в двух случаях в России xxiii). До 2020 года КОВ не считались особо смертоносными или вирулентными. SARS-подобные COV не требовали BSL-4 и могли быть обработаны с помощью BSL-2 и BSL-3[42] условия, повышающие вероятность случайной утечки. Эксперименты с аэрозолями с CoV [65] также могут привести к утечке в лаборатории, поскольку сбой в используемом оборудовании может оставаться незамеченным в течение длительного времени, прежде чем будет обнаружено заражение лабораторных работников. Наконец, вирус потенциально мог просочиться через канализационную систему, если не были соблюдены надлежащие процедуры удаления отходов и / или обеззараживания.

ВЫВОДЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ

На основе нашего анализа искусственное происхождение SARS-CoV-2 не является необоснованной теорией заговора, которую следует осудить [66], и исследователи несут ответственность за рассмотрение всех возможных причин возникновения SARS-CoV-2. Введение адаптированного к человеку RBD панголин-КоВ, полученного путем серийного пассажа клеток / животных и сайта расщепления фурина, может быть результатом экспериментов по мутагенезу, направленных на сайт, в контексте эволюционных исследований или разработки вакцин или лекарств против коронавируса панголина. Недавняя статья в Nature[67] подтверждает, что нельзя исключать лабораторное происхождение SARS-CoV-2, поскольку исследователи могли быть заражены случайно, и что эксперименты по усилению функции, приводящие к SARS-CoV-2, могли быть проведены в WIV. Генетические манипуляции с SARS-CoV-2 могли быть проведены в любой лаборатории в мире, имеющей доступ к основной последовательности и необходимому оборудованию, и это не оставило бы никаких следов. Современные технологии, основанные на платформах синтетической генетики, позволяют реконструировать вирусы на основе их геномной последовательности без необходимости в естественном изоляте.[68]

Срочно необходимо провести тщательное исследование коллекций штаммов и записей исследований во всех лабораториях, участвующих в исследованиях на КоВ, до вспышки SARS-CoV-2. Особое внимание следует уделять штаммам COV, которые были созданы в вирусологических лабораториях, но еще не опубликованы, поскольку они, возможно, описаны в удаленной базе данных WIV. Поскольку поиск возможного естественного хозяина может занять годы, как в случае с первой SARS[67], или никогда не увенчаться успехом, равный приоритет должен быть отдан исследованию естественного и лабораторного происхождения SARS-CoV-2.

Сяо Цян, ученый-исследователь из Беркли, недавно заявил: “Точное понимание того, как возник этот вирус, имеет решающее значение для предотвращения этого в будущем”.[xxi]

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы очень благодарны проф. Аллан Крилл (NTNU) за корректуру рукописи, все ценные комментарии и непредубежденность в отношении спорных гипотез; проф. Хериберту Инсаму (заведующему кафедрой микробиологии Университета Инсбрука) за поддержку и доктору Лоуренсу Селлину за всю полезную информацию. Особая благодарность доктору Фернандо Кастро-Чавесу (бывшему доктору Нью-Йоркского медицинского колледжа) за его поддержку в Research Gate. Мы очень благодарны Рене Бергельту за то, что он обнаружил базу данных, которая подтвердила наш вывод о том, что BtCoV4991 и RaTG13 относятся к одному и тому же образцу. Наконец, мы чрезвычайно благодарны членам группы D.R.A.S.T.I.C. (Децентрализованная радикальная автономная поисковая группа, расследующая COVID-19) в Твиттере за всю их работу по раскрытию многих ранее неопубликованных фактов о SARS-CoV-2 и связанных с ним штаммах. В частности, мы благодарны Луиджи Уоррену за постоянное изучение возможной связи вспышки пневмонии в Модзяне в 2012 году с ВИЧ и SARS-CoV-2, @TheSeeker268 за то, что он нашел диссертации на китайском языке 2013 года Сюя магистра и 2016 года Хуана доктора философии, которые подтвердили вирусную природу, подобную SARS, в Модзяне 2012 года вспышки пневмонии и разъяснили роль WIV в расследовании этой вспышки,xxiv, включая коллекцию штамма WIV 4991 / RaTG13 из шахты Моцзян, и Франсиско де Асис де Рибера Мартину за предоставление нам английского перевода двух тезисов, а также за обнаружение дат ампликона RaTG13.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

У Россаны Сегрето и Юрия Дейгина нет конфликта интересов.

References

1Sirotkin, K., & Sirotkin, D. (2020). Might SARS-CoV-2 have arisen via serial passage through an animal host or cell culture? A potential explanation for much of the novel coronavirus’ distinctive genome. BioEssays, 42, 1-7. https://doi.org/10.1002/bies.202000091
View
Web of Science®

2Andersen, K. G., Rambaut, A., Lipkin, W. I., Holmes, E. C., & Garry, R. F. (2020). The proximal origin of SARS-CoV-2. Nat. Med., 26, 450-452. https://doi.org/10.1038/s41591-020-0820-9
Full text versionView
CAS

3Zhou, P., Yang, X. L., Wang, X. G., Hu, B., Zhang, L., Zhang, W., … Shi, Z. L. (2020). A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature, 579, 270-273. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2012-7
Full text versionView
CAS

4Cagliani, R., Forni, D., Clerici, M., & Sironi, M. (2020). Computational inference of selection underlying the evolution of the novel coronavirus, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2. J. Virol., 94, 1-11. https://doi.org/10.1128/jvi.00411-20
Full text versionView
Web of Science®

5Ge, X. Y., Wang, N., Zhang, W., Hu, B., Li, B., Zhang, Y. Z., … Shi, Z. L. (2016). Coexistence of multiple coronaviruses in several bat colonies in an abandoned mineshaft. Virol. Sin., 31, 31-40. https://doi.org/10.1007/s12250-016-3713-9
View
CAS

6Wu, Z., Yang, L., Yang, F., Ren, X., Jiang, J., Dong, J., … Jin, Q. (2014). Novel henipa-like virus, mojiang paramyxovirus, in rats, China, 2012. Emerg. Infect. Dis., 20, 1064-1066. https://doi.org/10.3201/eid2006.131022
Full text versionView
PubMed

7Xu, L. (2013). The analysis of 6 patients with severe pneumonia caused by unknown viruses (Master's Thesis). Kunming Medical University, Emergency Medicine (professional degree). Google Scholar

8Huang, C. (2016). Novel virus discovery in bat and the exploration of receptor of bat coronavirus HKU9 (PhD Thesis). Chinese Center for Disease Control and Prevention. Google Scholar

9Wang, N., Luo, C., Liu, H., Yang, X., Hu, B., Zhang, W., … Shi, Z. (2019). Characterization of a new member of alphacoronavirus with unique genomic features in Rhinolophus bats. Viruses, 11(4), 379. https://doi.org/10.3390/v11040379
Full text versionView
CAS

10Chen, L., Liu, W., Zhang, Q., Xu, K., Ye, G., Wu, W., … Liu, Y. (2020). RNA based mNGS approach identifies a novel human coronavirus from two individual pneumonia cases in 2019 Wuhan outbreak. Emerg. Microbes Infect., 9, 313-319. https://doi.org/10.1080/22221751.2020.1725399
Full text versionView
CAS

11Cohen, J. (2020). Wuhan coronavirus hunter Shi Zhengli speaks out. Science, 369, 487-488. https://doi.org/10.1126/science.369.6503.487
Full text versionView
CAS

12Liu, P., Chen, W., & Chen, J. P. (2019). Viral metagenomics revealed sendai virus and coronavirus infection of malayan pangolins (Manis javanica). Viruses, 11(11), 979. https://doi.org/10.3390/v11110979
Full text versionView
CAS

13Bianchi, M., Benvenuto, D., Giovanetti, M., Angeletti, S., Ciccozzi, M., & Pascarella, S. (2020). Sars-CoV-2 envelope and membrane proteins: Structural differences linked to virus characteristics? Biomed. Res. Int., 2020. https://doi.org/10.1155/2020/4389089
Full text versionView
Web of Science®

14Schoeman, D., & Fielding, B. C. (2019). Coronavirus envelope protein: Current knowledge. Virol. J., 16, 1-22. https://doi.org/10.1186/s12985-019-1182-0
Full text versionView
CAS

15Hu, B., Zeng, L. P., Yang, X. Lou, Ge, X. Y., Zhang, W., Li, B., … Shi, Z. L. (2017). Discovery of a rich gene pool of bat SARS-related coronaviruses provides new insights into the origin of SARS coronavirus. PLoS Pathog., 13, 1-27. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1006698
Full text versionView
CAS

16Fan, Y., Zhao, K., Shi, Z. L., & Zhou, P. (2019). Bat coronaviruses in China. Viruses, 11(3), 210-. https://doi.org/10.3390/v11030210
Full text versionView
CAS

17Ge, X. Y., Li, J. L., Yang, X. Lou, Chmura, A. A., Zhu, G., Epstein, J. H., … Shi, Z. L. (2013). Isolation and characterization of a bat SARS-like coronavirus that uses the ACE2 receptor. Nature, 503, 535-538. https://doi.org/10.1038/nature12711
Full text versionView
CAS

18Graham, R. L., & Baric, R. S. (2010). Recombination, reservoirs, and the modular spike: Mechanisms of coronavirus cross-species transmission. J. Virol., 84, 3134-3146. https://doi.org/10.1128/jvi.01394-09
Full text versionView
CAS

19Menachery, V. D., Yount, B. L., Debbink, K., Agnihothram, S., Gralinski, L. E., Plante, J. A., … Baric, R. S. (2015). A SARS-like cluster of circulating bat coronaviruses shows potential for human emergence. Nat. Med., 21, 1508-1513. https://doi.org/10.1038/nm.3985
Full text versionView
CAS

20Johnson, B. A., Graham, R. L., & Menachery, V. D. (2018). Viral metagenomics, protein structure, and reverse genetics: Key strategies for investigating coronaviruses. Virology, 517, 30-37. https://doi.org/10.1016/j.virol.2017.12.009
Full text versionView
CAS

21Racaniello, V. (2016). Moving beyond metagenomics to find the next pandemic virus. PNAS, 113, 2812-2814. https://doi.org/10.1073/pnas.1601512113.
22Weiss, S., Yitzhaki, S., & Shapira, S. C. (2015). Lessons to be learned from recent biosafety incidents in the United States. Isr. Med. Assoc. J., 17, 269-273. https://doi.org/10.1073/pnas.1601512113

23Casadevall, A., & Imperiale, M. J. (2014). Risks and benefits of gain-of-function experiments with pathogens of pandemic potential, such as influenza virus: A call for a science-based discussion. MBio, 5, 1-5. https://doi.org/10.1128/mBio.01730-14

24Agostini, M. L., Andres, E. L., Sims, A. C., Graham, R. L., Sheahan, T. P., Lu, X., … Denison, M. R. (2018). Coronavirus susceptibility to the antiviral remdesivir (GS-5734) is mediated by the viral polymerase and the proofreading exoribonuclease. MBio, 9, 1-15. https://doi.org/10.1128/mBio.00221-18

25Xia, S., Liu, M., Wang, C., Xu, W., Lan, Q., Feng, S., … Lu, L. (2020). Inhibition of SARS-CoV-2 (previously 2019-nCoV) infection by a highly potent pan-coronavirus fusion inhibitor targeting its spike protein that harbors a high capacity to mediate membrane fusion. Cell Res., 30, 343-355. https://doi.org/10.1038/s41422-020-0305-x

26Totura, A. L., & Bavari, S. (2019). Broad-spectrum coronavirus antiviral drug discovery. Expert Opin. Drug Discov., 14, 397-412. https://doi.org/10.1080/17460441.2019.1581171

27Wang, Y., Sun, Y., Wu, A., Xu, S., Pan, R., Zeng, C., … Guo, D. (2015). Coronavirus nsp10/nsp16 Methyltransferase can be targeted by nsp10-derived peptide in vitro and in vivo to reduce replication and pathogenesis. J. Virol., 89, 8416-8427. https://doi.org/10.1128/jvi.00948-15

28Kuo, L., Godeke, G. J., Raamsman, M. J. B., Masters, P. S., & Rottier, P. J. M. (2000). Retargeting of coronavirus by substitution of the spike glycoprotein ectodomain: Crossing the host cell species barrier. J. Virol., 74, 1393-1406. https://doi.org/10.1128/jvi.74.3.1393-1406.2000

29Maier, H. J., Bickerton, E., & Britton, P. (2015). Coronaviruses – Methods and protocols. London: Humana Press.

30Becker, M. M., Graham, R. L., Donaldson, E. F., Rockx, B., Sims, A. C., Sheahan, T., … Denison, M. R. (2008). Synthetic recombinant bat SARS-like coronavirus is infectious in cultured cells and in mice. PNAS, 105, 19944-19949. https://doi.org/10.1073/pnas.0808116105

31Menachery, V. D., Yount, B. L., Sims, A. C., Debbink, K., Agnihothram, S. S., Gralinski, L. E., … Baric, R. S. (2016). SARS-like WIV1-CoV poised for human emergence. PNAS, 113, 3048-3053. https://doi.org/10.1073/pnas.1517719113

32Li, X., Zai, J., Zhao, Q., Nie, Q., Li, Y., Foley, B. T., & Chaillon, A. (2020). Evolutionary history, potential intermediate animal host, and cross-species analyses of SARS-CoV-2. J. Med. Virol., 92, 602-611. https://doi.org/10.1002/jmv.25731

33Lam, T. T. Y., Jia, N., Zhang, Y. W., Shum, M. H. H., Jiang, J. F., Zhu, H. C., … Cao, W. C. (2020). Identifying SARS-CoV-2-related coronaviruses in Malayan pangolins. Nature, 583, 282-285. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2169-0

34Xiao, K., Zhai, J., Feng, Y., Zhou, N., Zhang, X., Zou, J. J., … Shen, Y. (2020). Isolation of SARS-CoV-2-related coronavirus from Malayan pangolins. Nature, 583, 286-289. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2313-x

35Zhang, T., Wu, Q., & Zhang, Z. (2020). Probable pangolin origin of SARS-CoV-2 associated with the COVID-19 outbreak. Curr. Biol., 30, 1346-1351.E2. https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.03.022

36Coutard, B., Valle, C., de Lamballerie, X., Canard, B., Seidah, N. G., & Decroly, E. (2020). The spike glycoprotein of the new coronavirus 2019-nCoV contains a furin- like cleavage site absent in CoV of the same clade. Antivir. Res., 176, 104742. https://doi.org/10.1016/j.antiviral.2020.104742

37Letko, M., Marzi, A., & Munster, V. (2020). Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARS-CoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nat. Microbiol., 5, 562-569. https://doi.org/10.1038/s41564-020-0688-y

38Wang, Q., Qiu, Y., Li, J. Y., Zhou, Z. J., Liao, C. H., & Ge, X. Y. (2020). A unique protease cleavage site predicted in the spike protein of the novel pneumonia coronavirus (2019-nCoV) potentially related to viral transmissibility. Virol. Sin., 35, 337-339. https://doi.org/10.1007/s12250-020-00212-7

39Lau, S., Wang, P., Mok, B. W., Zhang, A. J., Chu, H., Lee, A. C., … Chen, H. (2020). Attenuated SARS-CoV-2 variants with deletions at the S1 / S2 junction. Emerg. Microbes Infect., 9, 837-842. https://doi.org/10.1080/22221751.2020.1756700

40Hoffmann, M., & Kleine-Weber, H. (2020). A multibasic cleavage site in the spike protein of SARS-CoV-2 is essential for infection of human lung cells. Mol. Cell., 78, 779-784.E5. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.04.022

41Kaundun, S. S., Marchegiani, E., Hutchings, S. J., & Baker, K. (2019). Derived polymorphic amplified cleaved sequence (dPACS): A novel PCR-RFLP procedure for detecting known single nucleotide and deletion – insertion polymorphisms. Int. J. Mol. Sci., 20(13), 3193. https://doi.org/10.3390/ijms20133193
Full text versionView
CAS

42Zeng, L. P., Gao, Y. T., Ge, X. Y., Zhang, Q., Peng, C., Yang, X. L., … Shi, Z. L. (2016). Bat severe acute respiratory syndrome-like coronavirus WIV1 encodes an extra accessory protein, ORFX, involved in modulation. J. Virol., 90, 6573-6582. https://doi.org/10.1128/JVI.03079-15
Full text versionView
CAS

43Khan, S. G., Muniz-Medina, V., Shahlavi, T., Baker, C. C., Inui, H., Ueda, T., … Kraemer, K. H. (2002). The human XPC DNA repair gene: Arrangement, splice site information content and influence of a single nucleotide polymorphism in a splice acceptor site on alternative splicing and function. Nucleic Acids Res., 30, 3624-3631. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC134237/.
Full text versionView
CAS

44Liu, Z., Zheng, H., Lin, H., Li, M., Yuan, R., Peng, J., … Lu, J. (2020). Identification of common deletions in the spike protein of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2. J. Virol., 94, e00790-20. https://doi.org/10.1128/JVI.00790-20
Full text versionView
CAS

45Zhou, H., Chen, X., Hu, T., Li, J., Song, H., Liu, Y., … Shi, W. (2020). A Novel bat coronavirus closely related to SARS-CoV-2 contains natural insertions at the S1/S2 cleavage site of the spike protein. Curr. Biol., 30, 2196-2203.E3. https://doi.org/10.1016/j.cub.2020.05.023
Full text versionView
CAS

46Steinhauer, D. A. (1999). Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus. Virology, 258, 1-20. https://doi.org/10.1006/viro.1999.9716
Full text versionView
CAS

47Seyran, M., Pizzol, D., Adadi, P., El-Aziz, T. M. A., Hassan, S. S., Soares, A., … Brufsky, A. M. (2020). Questions concerning the proximal origin of SARS-CoV-2. J. Med. Virol., 03. https://doi.org/10.1002/jmv.26478
PubMed

48Wang, L. F., & Anderson, D. E. (2019). Viruses in bats and potential spillover to animals and humans. Curr. Opin. Virol., 34, 79-89. https://doi.org/10.1016/j.coviro.2018.12.007
Full text versionView
CAS

49Wan, Y., Shang, J., Graham, R., Baric, R. S., & Li, F. (2020). Receptor recognition by the novel coronavirus from Wuhan: An analysis based on decade-long structural studies of SARS coronavirus. J. Virol., 94(7), 1-9. https://doi.org/10.1128/jvi.00127-20
Full text versionView
Web of Science®

50Cui, J., Li, F., & Shi, Z. L. (2019). Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nat. Rev. Microbiol., 17, 181-192. https://doi.org/10.1038/s41579-018-0118-9
Full text versionView
CAS

51Fraguas Bringas, C., & Booth, D. (2020). Identification of a SARS-like bat coronavirus that shares structural features with the spike glycoprotein receptor-binding domain of SARS-CoV-2. Access Microbiol., 10-17. https://doi.org/10.1099/acmi.0.000166.
Google Scholar
52Mallapati, S. (2020). Why does the coronavirus spread so easily between people? Nature, 579, 183. https://www.nature.com/articles/d41586-020-00660-x.
View
Web of Science®

53Almaz;n, F., Sola, I., Zu;iga, S., Marquez-Jurado, S., Morales, L., Becares, M., & Enjuanes, L. (2014). Coronavirus reverse genetic systems: Infectious clones and replicons. Virus Res., 189, 262-270. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2014.05.026
Full text versionView
CAS

54Cheng, J., Zhao, Y., Xu, G., Zhang, K., Jia, W., Sun, Y., … Zhang, G. (2019). The S2 subunit of QX-type infectious bronchitis coronavirus spike protein is an essential determinant of neurotropism. Viruses, 11(10), 972. https://doi.org/10.3390/v11100972
Full text versionView
CAS

55Wrapp, D., Wang, N., Corbett, K. S., Goldsmith, J. A., Hsieh, C. L., Abiona, O., … McLellan, J. S. (2020). Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation. Science, 367, 1260-1263. https://doi.org/10.1126/science.abb2507
Full text versionView
CAS

56Du, L., Tai, W., Yang, Y., Zhao, G., Zhu, Q., Sun, S., … Li, F. (2016). Introduction of neutralizing immunogenicity index to the rational design of MERS coronavirus subunit vaccines. Nat. Commun., 7, 1-9. https://doi.org/10.1038/ncomms13473
Full text versionView
Web of Science®

57Wahl, A., De, C., Abad Fernandez, M., Lenarcic, E. M., Xu, Y., Cockrell, A. S., … Garcia, J. V. (2019). Precision mouse models with expanded tropism for human pathogens. Nat. Biotechnol., 37, 1163-1173. https://doi.org/10.1038/s41587-019-0225-9
Full text versionView
CAS

58Hu, D., Zhu, C., Ai, L., He, T., Wang, Y., Ye, F., … Wang, C. (2018). Genomic characterization and infectivity of a novel SARS-like coronavirus in Chinese bats. Emerg. Microbes Infect., 7, 1-10. https://doi.org/10.1038/s41426-018-0155-5
Full text versionView
PubMed

59Hron, T., Farka;ov;, H., Gifford, R. J., Benda, P., Hulva, P., G;rf;l, T., … Elleder, D. (2018). Remnants of an ancient deltaretrovirus in the genomes of horseshoe bats (Rhinolophidae). Viruses, 10(4), 185-. https://doi.org/10.3390/v10040185
Full text versionView
Google Scholar
60Shang, J., Ye, G., Shi, K., Wan, Y., Luo, C., Aihara, H., … Li, F. (2020). Structural basis of receptor recognition by SARS-CoV-2. Nature, 581, 221-224. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2179-y
Full text versionView
CAS

61Wertheim, J. O. (2010). The re-emergence of H1N1 influenza virus in 1977: A cautionary tale for estimating divergence times using biologically unrealistic sampling dates. PLoS ONE, 5, 2-5. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0011184
62Cyranoski, D. (2019). Chinese institutes investigate pathogen outbreaks in lab workers. Nature, https://www.nature.com/articles/d41586-019-03863-z

63Lim, P. L., Kurup, A., Gopalakrishna, G., Chan, K. P., Wong, C. W., & Leo, Y. S. (2004). Laboratory-acquired severe acute respiratory syndrome. N. Engl. J. Med., 350, 1740-1745. https://doi.org/10.1056/NEJMoa032565

64Cyranoski D. (2017). Inside the Chinese lab poised to study world's most dangerous pathogens. Nature, 542, 399-401 https://doi.org/10.1038/nature.2017.21487

65Totura, A., Livingston, V., Frick, O., Dyer, D., Nichols, D., & Nalca, A. (2020). Small particle aerosol exposure of African Green Monkeys to MERS-CoV as a model for highly pathogenic coronavirus infection. Emerg. Infect. Dis., 26. https://doi.org/10.3201/eid2612.201664.

66Calisher, C., Carroll, D., Colwell, R., Corley, R. B., Daszak, P., Drosten, C., … Turner, M. (2019). Statement in support of the scientists, public health professionals, and medical professionals of China combatting COVID-19. The Lancet, 395, E42-E43. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)30418-9

67Cyranoski, D. (2020). The biggest mystery: What it will take to trace the coronavirus source. Nature, https://doi.org/10.1038/d41586-020-01541-z.

68Thao, T. T. N., Labroussaa, F., Ebert, N., V'kovski, P., Stalder, H., Portmann, J., … Thiel, V. (2020). Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform. Nature, 582, 561-565. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2294-9