Очередной этап исторического развития народа тимукуа начался после 1565 года, то есть тогда, когда испанцы, победившие французов в схватке за Флориду, основали на восточном ее побережье свою первою колонию Сент-Огэстин. По сути, в это время произошел раскол в среде аборигенов, воспользовались которым монахи иезуиты. Миссионеры приходили в города тимукуа с целью проповеди Евангелия, а также несли свет цивилизации белого человека. Они знакомили индейцев с новыми видами сельскохозяйственных культур, а также старались привить в их сознание несвойственный ранее им частнособственнический тип мышления.
Первая католическая миссия в стране тимукуа была основана при колонии Сент-Огэстин, но начало всеобщей миссионерской деятельности францисканцев, сменивших к тому времени на пастырскому посту иезуитов, приходиться на начало 70-х годов ХVI века. Францисканцы, как впрочем, и иезуиты, предпринимали попытки преобразования дикарей в лояльных испанской короне подданных. Пик христианизации тимукуанских племен пришелся на 1595 год, то есть то время, когда численность народа в результате перенесенных им эпидемических заболеваний сократилась с 200 000 до 50 000 человек. К этому периоду, на территории занимаемой народом тимукуа, проживало всего 13 племен.
В вождестве Мокама-Гуадалквини (Mocama-Guadalquini, побережье Северо-восточной Флориды и часть Юго-восточной Джорджии) осуществляли деятельность три францисканских миссии.
К северу от озера Джордж располагалось вождество Энекапе (Enecape), где практиковали священники миссии Сан-Антонио-де-Энекапе (San Antonio de Enecape).
На территории современных округов Самтер и Марион находилась вождество Окале (Ocale), где функционировала всего одна миссия, хотя ранее, в эпоху первых контактов с европейцами численность населения указанного вождества составляла около 60 000 человек.
Также одна миссия была основана для окормления индейцев вождества Акуэра (Acuera), располагавшегося у реки Оклаваха.
В месте расположения вождества Потано (Potano, территория современного округа Алачуа) францисканцы основали четыре миссии, две из которых просуществовали до 1620 года.
Четыре миссии работало и в землях вождества Утина (Utina, округа Колумбия и Сувонни).
Вождество Юстага (Yustaga, округа Мэдисон и Гамильтон во Флориде, и Южная Джорджия, к востоку от реки Аукилла) впитало в себя восемь миссий просуществовавших до 1623 года. Самой известной миссией, находившейся на территории данного вождества, считалась миссия Сан-Мигель-де-Асиль (San Miguel de Asile).
На территории вождества Алапаха (Alapaha, верхнее течение реки Алапаха, Джорджия) располагалась одна миссия.
На пересечении рек Окмулги и Окони базировалось вождество Утинахика (Utinahica), на территории которого функционировала одна католическая миссия.
В южной части болот Окефеноки раскинулись деревни вождества Окони (Oconi), жители которых были приписаны всего лишь к одной миссии.
Миссия Сан-Лоренцо (San Lorenzo) опекала индейцев вождеств Ибихика (Ibihica) и Каскангуи/Икафуи (Cascangue/Icafui), располагавшихся на самом востоке Юго-восточной Джорджии, и исчезнувших с испанских карт в самом начале ХVII века.
В период с 1595 по 1700 годы, как утверждает исследователь Миланич, положение индейцев тимукуа при миссиях было катастрофическим. Численность этого народа снизилась на 98 процентов, то есть от 50 000 до 1000 человек.
Жесткая эксплуатация труда индейцев со стороны колониальной администрации, а также отсутствие медицинского обеспечения привели к обнищанию и массовому мору народа тимукуа, и как следствие данного процесса его моральной и этнокультурной деградации. Индейцы все меньше оставались похожими на индейцев, и приобретли черты типичных окатоличенных испанцев.
Жизнь близ испанских поселений означала постоянный риск подхватить какую-нибудь инфекцию. Тысячи тимукуа умирали от болезней белого человека, от чего их города становились безлюдными.
Для того чтобы как-то выжить, мужское население тимукуанских поселений покидало насиженные места, и уходило на работу в Сент-Огэстин, где индейцев за плошку супа нанимали строить дома и дороги, а также работать на кукурузных плантациях испанцев. Если индейца нанимали за мизерную плату, то его счастью не было предела. На заработанные деньги он мог приобрести полезные для него вещи – топоры, мотыги и рыболовные снасти, которые существенно облегчали его существование.
Именно индейцы тимукуа являются авторами дорожной магистрали того времени соединившей форт Сент-Огэстин с городом Таллахасси в стране индейцев апалачи. За счет эксплуатации труда тимукуанских племен испанцам удалось построить эту важную в экономическом плане дорогу соединявшую восток и север Флориды. Эта дорога получила название «Камино Риал» (Camino Real или Ka-mee-no Reh-al). Строительство магистрали обуславливалось необходимостью в обеспечении кукурузных плантаций в районе расположения Сент-Огэстина индейской рабочей силой. Поскольку численность представителей народа тимукуа к тому времени существенно снизилась, то на кукурузные плантации в Сент-Огэстин испанцы по этой дороге стали доставлять индейцев апалачи. Также по этой дороге на север Флориды шел и урожай кукурузы.
Для того чтобы хоть как-то обеспечить работой население провинции Тимукуа, испанцы привлекали мужчины к охране магистрали «Камино Риал». Те из тимукуа, кому не посчастливилось получить работу в обеспечении функционирования магистрали, нанимались батраками на испанские скотоводческие фермы.
В целом систему организации индейского труда при миссиях Флориды можно характеризовать как паразитическую. Квоты на индейский труд, которые выделала колониальная администрация католическим миссиям в стране тимукуа, были мизерными и предполагали только работу на территории небольшого региона прилегавшего к форту Сент-Огэстин и в самом форту.
Флорида была самой нищей испанской колонией того времени и ее экономическое положение целиком зависело от эксплуатации труда коренного аборигенного населения полуострова, численность которого к концу ХVII века оставляла желать лучшего. По этой причине выживаемость колонии находилась под угрозой. Чтобы спасти положение, чиновники колониальной администрации, стали проводить реформу индейских поселений. Отдельные, малонаселенные города в стране тимукуа ликвидировались, а их население переселялось в окрестности Сент-Огэстина. Зачастую в одном большом поселении концентрировались представители племен, исторически между собой враждовавшие, что в значительной степени повышло криминогенную обстановку в данном селении. В целях снижения криминогенного уровня испанцы стали размещать целые индейские семьи на гасиендах помещиков, где владельцы поместий использовали индейцев в качестве батраков, а по сути, в качестве рабов.
Надсмотрщиками над индейцами гасиенд выступали, как правило, рабы негры, с которыми у тимукуа возникали конфликты, систематически заканчивавшиеся поножовщиной.
В 1647 году против испанского владычества подняли восстание индейцы апалачи. Восстание возглавили лидеры традиционалистов, собравшие под свои знамена представителей ряда северных племен полуострова. Тимукуа в данном конфликте заняли сторону колониальных властей. Сводный отряд из 31 испанского солдата и 500 воинов тимукуа вступил в схватку с 8000 воинами повстанцев. В одном из генеральных сражений подавляющее число воинов тимукуа пало, однако восстание апалачи, в итоге было подавлено.
В 1656 году против испанцев выступили уже сами тимукуа.
Губернатор Флориды, получив сведения о грядущем нападении англичан и союзных им индейцев ямаси на Сент-Огэстин, приказал вождям племен тимукуа, апалачи и гуале для защиты форта предоставить 500 воинов. Кроме того, он обязал вождей указанных племен обеспечить каждого воина продуктами питания, которые они должны были доставить в Сент-Огэстин. Возмущенные наложенными бременами вожди, высказали претензии испанским властям, упрекнув их в том, что те не соблюдают элементарных правил мобилизации, которые сами же и установили. Испанцы, призывая на службу индейцев на период военных действий, обязывались в течение шести недель кормить и поить их за счет бюджета, а также обмундировывать и вооружать индейцев. Призывая индейцев встать на оборону Сент-Огэстина в 1656 году, данные требования испанские власти проигнорировали, в связи с чем, верховный кацик тимукуа Менендес Лукас призвал индейское население провинции к восстанию, к которому присоединились также апалачи и гуале. Менендес Лукас приказал убивать всех испанцев кроме монахов-францисканцев. Лукас заявил: «Наш гнев не против Церкви Христовой и ее служителей, а против солдат короля и их командиров, которые всегда жестоко обращались с нами».
В ходе восстания, индейцы тимукуа изобрели свой собственный шифр, который использовали для связи между отрядами. Шифр состоял из слов языка тимукуа, на котором к тому времени, благодаря научным изысканиям проведенным отцом Пареха, читали и писали многие представили этого народа. Тимукуа также научились расшифровывать перехватываемую ими испанскую корреспонденцию, содержание которой не было для них тайной, поскольку письменность тимукуа базировалась на испанском алфавите.
Кульминацией восстание стала осада испанским отрядом численностью 60 солдат и 200 воинов апалачи крепости Санта-Елена-де-Махава (Santa Elena de Machava), где засели тимукуа под предводительством Менендеса Лукаса. В ходе длительных переговоров осажденные сдались и были взяты под арест.
Вслед за этим в стране тимукуа начались репрессии, которые устроили испанцы в профилактических целях. Во всех городах над жителями, которые являлись участниками восстания, испанцы устраивали показательные суды. Половина осужденных индейцев тимукуа были приговорены к казни через повешение, остальные же к отбыванию каторжных работ в Сент-Огэстине. Виселицы с повешенными повстанцами испанцы установили на всей протяженности тракта Камино Риал, в качестве напоминания индейцам о том, «кто в их доме хозяин».
В начале 1660-х годов ветхий экономический базис испанской Флориды постепенно подрывала британская торговля. Британцы поставляли индейцам Флориды необходимую им хозяйственную утварь по демпинговым ценам.
К тому времени, Великобритания основала колонии в Северной и Южной Каролинах, и стала простирать свои экспансионистские взоры на Джорджию и Флориду. В этой связи англичане заключили ряд мирных договоров с индейцами ямаси, проживавшими на территории Южной Каролины, вооружили их огнестрельным оружием и принудили их лидеров совершать набеги на испанские мисси в Джорджии и Флориде.
Вторжение ямаси во Флориду в период 1660-е – 1680-е годы, исследователи сравнивают со смертоносным смерчем, который пронесся по этой земле, опустошая все на своем пути. Миссии, расположенные близ тракта Камино Риал и охраняемые тимукуа, а также кукурузные поля вдоль этого пути, обрабатываемые индейцам и апалачи и гуале, были полностью уничтожены отрядами пришельцев. Оставшиеся в живых жители индейских деревень располагавшихся близ указанного тракта, в срочном порядке были вынуждены эвакуироваться к Сент-Огэстину.
Испанцы понимали, что рано или поздно, англичане и союзные им племена криков и ямаси дойдут и до Сент-Огэстина. Для того чтобы защитить поселение от набегов пришлых племен, испанцы обратились за помощью к тимукуа, с помощью которых построили ряд дополнительных фортификационных сооружений из ракушечника. Помимо этого из числа мужчин тимукуа они создали военизированные отряд милиции. Когда англичане все же осуществили нападение на Сент-Огэстин, то форт устоял, однако большинство защищавших подступы к нему индейцев тимукуа, погибли и были взяты в плен.
Согласно данным испанской переписи населения 1717 года в окрестностях Сент-Огэстина находилось всего три селения тимукуа, в которых проживало всего 250 индейцев этнически принадлежавших к этому народу. В 1726 году их численность сократилась до 157 человек, а два года спустя до 70 человек. К 1752 году насчитывалось всего 29 тимукуа, которые проживали на территории всего одной деревни. А десять лет спустя, то есть к 1763 году, когда Испания, подписав договор с Великобританией, отдавала ей Флориду, в живых оставался всего один представитель народа тимукуа, который в итоге покинул свою землю с испанцами, эвакуировавшись на Кубу. Его имя Хуан Алонсо Кабале (Juan Alonso Cabale), он умер в 1767 году на Кубе, вместе с ним умерла и культура народа тимукуа.