Кто скажет и откроет мне,
Какую тайну в тишине
Хранят растения живые?
С.Есенин. Письмо к Панфилову.
Фотолюминесценция (свечение после поглощения возбуждающего света) используется для исследования в различных областях деятельности человека. В биологических системах чаще анализируют свечение малой продолжительности ( менее 10-6 секунд), называемой флуоресценцией в отличие от более длительной фосфоресценции. Под действием ультрафиолетового света в люминесцентный микроскоп в видимой области спектра (400-750 нм) наблюдается их собственная флуоресценция. Клетки микробов и грибов ярко светятся сине-зеленым светом, а клетки животных слабо - в голубой области ( при повреждении еще и в зелено-желтой). Различные же клетки растений могут флуоресцировать во всем диапазоне видимого спектра. По сравнению с клетками животных растительные клетки светятся с большей интенсивностью и, благодаря исключительному богатству пигментов демонстрируют больше вариаций по цвету испускаемого свечения.
Целый флуоресцирующий разноцветный мир растительных клеток наблюдается в люминесцентный микроскоп! Ярко-красная флуоресценция зеленых фотосинтезирующих клеток обусловлена присутствием зеленых пигментов хлорофиллов. Бесхлорофилльные клетки зрелой пыльцы и секреторные клетки (волоски, железки) светятся преимущественно голубым или желто-зеленым светом, что связано с присутствием фенолов, терпенов и других соединений. Исследования, проведенные в лаборатории микроспектрального анализа и клеточного мониторинга окружающей среды Института биофизики клетки Российской Академии Наук показали, что флуоресценция неповрежденных клеток растений позволяет диагностировать клетки с разным химическим составом, оценивать изменения оболочек и содержимого клеток в процессе развития и под действием неблагоприятных факторов. Открылись новые перспективы исследований прижизненной биохимии клеток, изменения в метаболизме которых до этого анализировали только с помощью методик, разрушающих клеточные структуры. Помимо визуального наблюдения флуоресценции в люминесцентный микроскоп была применена и специальная аппаратура, микроспектрофлуориметр для регистрации спектров флуоресценции одиночных клеток животных , растений и микроорганизмов. Оригинальная технология прибора запатентована в 80-е годы во многих странах и была удостоена Ленинской и Государственной премий. С помощью этого прибора регистрировали спектры флуоресценции отдельных клеток и даже их структур - клеточной стенки и цитоплазмы. В зависимости от специализации растительной клетки, фазы ее развития и влияния внешних факторов в этих спектрах появлялись и исчезали пики ( максимумы), что отражает превращения определенных веществ.
Что же удалось установить? Какие открылись возможности и какие проблемы встали перед исследователями ? Прежде всего нами было показано, что наиболее ценную информацию дает анализ секреторных клеток волосков и железок растений. В обычный микроскоп они плохо различимы на фоне основной массы бесцветных, зеленых или желтовато-темных тканей. Иное дело, когда растительная поверхность облучается ультрафиолетовым светом под люминесцентным микроскопом. Анализ неповрежденных секреторных клеток более 100 видов растений, содержащих разнообразные светящиеся продукты метаболизма - фенолы и терпеноиды, алкалоиды и полиацетилены. Секреторные структуры резко выделялись среди несветящихся или имеющих другой цвет свечения участков тканей. Светится также секретирующая поверхность клеток пыльцы ( мужского гаметофита).Еще одним примером может служить специализированная ткань ловушки плавающего в воде насекомоядного растения пузырчатки Utricularia. Ее рассеченные листья выглядят как нить с ловушками, покрытыми железками с ловчей слизью. Под люминесцентным микроскопом поверхность ловушки светится красным светом за счет зеленого пигмента хлорофилла. На красном фоне хорошо заметны слизе-содержащие железки, которые имеют желтое свечение. Это позволяет разглядеть их структуру. В спектрах флуоресценции слизевых железок (сплошная линия) и выделившегося из них секрета (штриховая линия) имеется один и тот же максимум (545 нм ) свечения в желтой области спектра. Этот максимум отсутствует в спектрах флуоресценции несекреторных клеток (точечная линия), а виден максимум 680 нм, относящийся к красной флуоресценции хлорофилла. Желтое свечение слизевых железок обусловлено, по-видимому, присутствием алкалоидов . Люминесценция разных типов секреторных клеток , как выяснилось, отличается в зависимости от химического состава секрета. Голубое или сине-зеленое свечение отмечено у терпеноид-содержащих секреторных волосков мяты, у содержащих фенолы и алкалоиды секреторных клеток окопника, у фенол-содержащих клеток почек березы. Желтое или оранжевое свечение часто наблюдается у секреторных клеток корней бархатцев, заполненных полиацетиленами и алкалоидами, тогда как основная масса несекреторных клеток флуоресцирует голубым светом. Секретирующая поверхность пыльцы ( мужского гаметофита) флуоресцирует в зависимости от состава секрета и поверхностных пигментов (фенолов, каротиноидов, азуленов и др.) в синей , желтой . зеленой и красной области спектра. Хотя ранее ботаники отмечали у некоторых растений флуоресценцию секреторных клеток, однако не придавали этому явлению значения как диагностическому признаку.
После специальных исследований показано, что у многих растений можно идентифицировать соответствующие секреторных клетки под люминесцентным микроскопом. Это важно для ботанической практики и изучения состава секретов, поскольку секреторные клетки - источники самых разнообразных биологически активных продуктов, в том числе веществ, привлекающих или отпугивающих насекомых , а также защитных от инфекции и поедания животными соединений. Обилие секреторных структур, содержащих фармакологически важные соединения, характерно для многих лекарственных растений, и накопление в них секрета можно оценивать по характеру и интенсивности флуоресценции. Флуоресценция пестика (в котором после мейоза в семяпочке образуется гаплоидный зародышевый мешок - женский гаметофит) и пыльцы (мужского гаметофита), участвующих в оплодотворении растений , также дает очень важную информацию . Прежде всего - об их физиологическом состоянии, способности к нормальному оплодотворению, а также их чувствительности к загрязнителям окружающей среды. Было показано, что при прорастании пыльцы на искусственной питательной среде гасится флуоресценция жизнеспособных пыльцевых зерен, которые прорастают, образуя пыльцевую трубку (по ней к яйцеклетке движутся спермии). Нежизнеспособные пыльцевые зерна, напротив, ярко светятся, и в дальнейшем не прорастают. Таким образом уже в в первые минуты после смачивания водой пыльцы наблюдение ее флуоресценции под люминесцентным микроскопом позволяет выявить различия между жизнеспособными и нежизнеспособными пыльцевыми зернами. Анализируя спектры флуоресценции пыльцы, удается довольно четко отличить пыльцу у самонесовместимых ( неспособных к самоопылению) и самосовместимых ( способных оплодотворяться собственной пыльцой) растений одного вида. Например у петунии в спектрах флуоресценции пыльцы самонесовместимых растений отсутствуют или снижены максимумы характерные для каротиноидов и азуленов. Следует отметить, что пыльца растений чувствительна к различным неблагоприятным факторам. Под их влиянием, а также при длительном хранении разрушаются многие пигменты на ее поверхности, и это обычно также сопровождается потерей жизнеспособности. Флуоресцентный анализ пыльцевых зерен позволяет это быстро установить. Например, под влиянием высоких концентраций озона и перекисей воздуха, а также облучения ультрафиолетовым светом разрушаются каротиноиды, и исчезает свойственная им флуоресценция в желто-оранжевой области спектра. Таким образом микрофлуориметрический анализ позволяет без длительных процедур выращивания растений и биохимического контроля обнаружить жизнеспособность пыльцы и ее готовность к оплодотворению , что очень важно для практической работы генетиков и селекционеров.
Не только практическая значимость феномена флуоресценции пыльцы и пестика привлекает исследователей. Поразительно, что флуоресценция поверхности пестика характеризует способность распознавать пыльцу своего или чужого вида. В 1994 году впервые были получены спектры флуоресценции контактирующих поверхностей пестика и пыльцы на целом растении, в которых в течение нескольких секунд после контакта появлялись новые максимумы и исчезали старые. Это происходило только в ответ на соприкосновение с клетками собственного вида, но не чужого. Несмотря на манипуляции под люминесцентным микроскопом ( снятие спектров флуоресценции пыльцы на пестике и поверхности пестика с лежащей на нем пыльцой) пыльца, попавшая на пестик своего вида, нормально прорастала, происходило оплодотворение, формировался зародыш, и в дальнейшем образовывались плоды и жизнеспособные семена.
Возможности анализа флуоресценции растительных клеток еще далеко не изучены. Новые исследования могут привести к открытиям в флуоресцирующем мире живых организмов.
Литература
Рощина В.В., Мельникова Е.В., Карнаухов В.Н. (2000) Флуоресцирующий мир растительных клеток. // Наука в России. 2000. № 6, C.53-56.
Roshchina VV (2008) Fluorescing World of Plant Secreting Cells. Science Publisher : Enfield , Jersey (USA), Plymouth. 338 pp